Specific features of the adhesion process of the abdominal cavity in children with different degrees of connective tissue dysplasia

Full Text

Введение

С увеличением количества оперативных вмешательств на органах брюшной полости возрастает количество пациентов, имеющих различные проявления интраабдоминального спаечного процесса [1, 2]. При этом развивающиеся осложнения занимают ведущее место в структуре причин заболеваемости и смертности в абдоминальной хирургии [3, 4]. Изучение патогенеза спаечного процесса в брюшной полости на сегодняшний день представляется актуальной задачей [5, 6]. Формирующийся регенеративный ответ соединительной ткани на повреждение брюшины — это пусковой механизм каскадной реакции в формировании спаечного процесса в брюшной полости [7]. Патогенез спаек — многофакторный и недостаточно изученный процесс, в котором ведущую роль отводят выпадению фибрина [8, 9]. Сформированный фиброзный процесс приводит к развитию кишечной непроходимости [10, 11].

В литературных источниках существует ограниченное количество работ, изучающих патоморфологические особенности формирования спаечного процесса в детском возрасте [12, 13]. Особенно значимо изучение данного состояния у детей с недифференцированной дисплазией соединительной ткани (НДСТ). Дисплазия соединительной ткани (ДСТ) представляет генетически детерминированное нарушение развития соединительной ткани в эмбриональном и постнатальном периодах, характеризующееся дефектами волокнистых структур и основного вещества, приводящее к расстройству гомеостаза на тканевом, органном и организменном уровнях в виде различных морфофункциональных нарушений висцеральных и локомоторных органов с проградиентным течением [14]. В основе НДСТ лежит не четкий генетический маркер (генетический дефект с определенным типом наследования), а мультифакторные воздействия на плод, способные вызвать дефекты генетического аппарата [15–17]. Вместе с этим исследование патоморфологических и иммуногистохимических (ИГХ) особенностей спаечного процесса после хирургического вмешательства у детей является очень важным для решения вопросов дальнейшего лечения и профилактики [18–20].

Цель исследования — проведение комплексной оценки течения спаечного процесса брюшной полости у детей с различной степенью выраженности дисплазии соединительной ткани.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе ГБУЗ СК «Краевая детская клиническая больница» Ставрополя и ГБУЗ «Магаданская областная детская больница» Магадана. Под нашим наблюдением находился 91 ребенок в возрасте 10,6 ± 1,4 года в период с 2005 по 2019 г. Мальчиков было 53 (58,2 %), девочек — 38 (41,8 %). Критериями включения в исследование были: наличие в анамнезе оперативного вмешательства на органах брюшной полости; отсутствие сопутствующей патологии; развитие клиники спаечной болезни; согласие на участие в исследовании. Критерии не включения в исследование: наличие сопутствующей патологии, требующей медикаментозной коррекции; отсутствие согласия на участие в исследовании; аллергическая реакция в анамнезе.

Пациенты были разделены на 2 группы: группа 1 (69 детей без проявлений ДСТ) и группа 2 (22 пациента с проявлениями ДСТ). Для диагностики ДСТ были использованы клинические данные и скрининговые карты, результаты ультразвукового исследования и рентгенологические данные, электрокардиограмма. Выявление у одного пациента 6 стигм дизэмбриогенеза и более считали подтверждением синдрома дисплазии соединительной ткани, а также учитывали данные морфологического исследования [21, 22].

Характеристика нозологических форм у пациентов с развившимся синдромом кишечной недостаточности (СКН): недеструктивная форма острого аппендицита — катаральный аппендицит — 5 (5,5%) пациентов; деструктивные формы острого аппендицита — флегмонозный аппендицит — 47 (51,6 %), гангренозный аппендицит — 14 (15,4 %), гангренозно-перфоративный аппендицит — 25 (27,5 %) человек. Характеристика проводимых оперативных вмешательств, выполненных по-поводу СКН: лапаротомия — 40 (43,9 %) случаев, лапароскопия — 51 (56,1 %). Характер оперативных вмешательств по группам был следующим. В группе 1: лапаротомию с адгезиолизисом проводили у 9 (13,0 %) пациентов; лапароскопию с адгезиолизисом — у 13 (18,8 %); лапаротомию с адгезиолизисом и резекцией большого сальника — у 20 (29,1 %); лапароскопию с адгезиолизисом и резекцией большого сальника — у 27 (39,1 %). В группе 2: лапаротомию с адгезиолизисом проводили у 3 (13,6 %) пациентов; лапароскопию с адгезиолизисом — у 4 (18,2 %); лапаротомию с адгезиолизисом и резекцией большого сальника — 6 (27,3 %); лапароскопию с адгезиолизисом и резекцией большого сальника — 9 (40,9 %).

В настоящее время существуют различные способы и шкалы оценки выраженности спаечного процесса в брюшной полости. В характеристике клинических проявлений использовалась классификация Р.А. Женчевского (1989), отражающая клинические стадии развития спаечного процесса.

У всех больных в исследуемых группах нами проведена макроскопическая визуальная оценка выраженности спаечного процесса в брюшной полости по трем различным шкалам:

1) Nair и соавт. [23]: 0 — нет спаек; 1 — одиночная неваскуляризированная спайка между внутренними органами либо органом и брюшной стенкой; 2 — 2 спайки ограниченного кровоснабжения и умеренной толщины; 3 — более 2 хорошо васкуляризированных и толстых спаек; 4 — внутренние органы представлены конгломератом либо плотно спаяны с брюшной стенкой;

2) F. Coccolini и соавт. [35] на основе индекса PAI (peritoneal adhesion index), где рассчитываются выраженность спаечного процесса от 0 до 3 баллов в 9 квадрантах брюшной полости (от А до I), наличие межкишечного конгломерата (L) — 3 балла, максимальная сумма —30 баллов;

3) Н.И. Аюшинова и соавт. [25] — оценка спаечного процесса брюшной полости с их морфологическим строением. Каждый критерий оценивался от 0 (отсутствие признака) до 4 баллов (максимальная выраженность признака), полученные баллы по всем категориям суммировались. В соответствии с критериями выделены 3 степени выраженности спаечного процесса: 0–4 балла — 1-я степень (незначительный адгезивный процесс); 5–10 баллов — 2-я степень (умеренный адгезивный процесс); 10 баллов и выше — 3-я степень (выраженный адгезивный процесс).

Биоматериал для исследования был взят при проведении лапароскопического или традиционного адгезиолизиса. Полученный материал был изучен на базе гистохимической лаборатории кафедры гистологии Ставропольского государственного медицинского университета. ИГХ-исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином (Menzel-Glaser, Германия). Для освобождения антигенов после фиксации формалином использовали тепловую демаскировку антигенов в микроволновой печи Samsung при мощности 800 Вт в течение 10 мин в цитратном буфере при рН 6,0. Первичными антителами являлись моноклональные антитела к коллагену I, III, IV типов (Dako, Дания). Определяли количество окрашенных в коричневый цвет коллагеновых волокон в 10 полях зрения на площади 502,08 мкм² увеличение ×40, ×100, ×400 (микроскоп Olympus CX-41). Использовали моноклональные антитела к белку базальной мембраны ламинину (Laminin γ1, R&D Systems, Inc.), факторам ангиогенеза: васкулоэндотелиальному фактору VEGF (R&D Systems, Inc.), основному фактору роста фибробластов (bFGF), белку, контролирующему пролиферацию и клеточную дифференцировку (TGF-beta), мембранному белку из семейства рецепторов фактора роста фибробластов (FGFR1) (R&D Systems, Inc.). Метод полуколичественного подсчета использовали для регистрации относительного количества иммунопозитивных структур [31, 35] со следующими обозначениями:

0 — нет положительных структур в поле зрения;

0/+ — изредка позитивные структуры в поле зрения;

+ — несколько позитивных структур в поле зрения;

+/++ — от нескольких до умеренных позитивных структур в поле зрения;

++ — умеренные позитивные структуры в поле зрения;

++/+++ — от умеренных до многочисленных положительных структур в поле зрения;

+++/++++ — множество положительных структур в области зрения;

++++ — обильные позитивные структуры в поле зрения.

Количество структур было проанализировано в пяти полях зрения случайно выбранного раздела. Среднее количество структур было выбрано для дальнейшего анализа. Контрольную реакцию проводили без использования первичных специфических антител (негативный контроль).

Статистический анализ с помощью программы Statistica v.10.0 осуществляли методами вариационной статистики с использованием хи-квадрат-теста. Исследованные группы сравнивали при помощи U-теста Манна–Уитни. Чтобы определить тесноту (силу) и направление корреляционной связи между двумя признакам или двумя профилями признаков использовали метод ранговой корреляции Спирмена (rs). Полученные результаты были интерпретированы: rs < 0,35 — слабая корреляция, 0,35 < rs < 0,7 — умеренная корреляция, rs > 0,7 — сильная корреляция. Двусторонние значения р < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

При анализе клинических проявлений у детей в группе 1 преобладали следующие клинические проявления: схваткообразный болевой синдром малой и средней степени (61; 88,4%), рвота (54; 78,3 %), при осмотре — вздутие живота (61; 88,4 %), его асимметрия и видимая перистальтика (8; 11,6 %); у детей в группе 2: выраженный болевой синдром (20; 90,9 %), при осмотре — вздутие живота (22; 100 %). Преобладающим типом СКН в группе 1 был обтурационный тип СКН (46; 66,7 %), в группе 2 — странгуляционный тип СКН (21; 86,4 %).

При макроскопическом осмотре наиболее часто спайки были визуализированы между петлями тонкого кишечника и куполом слепой кишки, а также сальником (58; 63,7 %). При визуализации спаечного процесса в брюшной полости по шкале Nair: в группе 1 средний балл составил 4,1 ± 0,2 балла, в группе 2 — 2,7 ± 0,4 балла (rs < 0,35; р < 0,05); по шкале F. Coccolini: в группе 1 — 17 ± 0,9 балла, в группе 2 — 12 ± 1,1 балла (rs < 0,35; р < 0,05); по шкале Н.И. Аюшинова: в группе 1 — 14 ± 1,2 балла, в группе 2 — 7 ± 0,8 балла (rs < 0,35; р < 0,05), что также отображено в сравнении исчисляемых показателей достоверности (табл. 1).

 

Таблица 1. Критерий выраженности спаечного процесса в брюшной полости (по интраоперационным данным) / Table 1. Severity Criterion of adhesion of the abdominal cavity (by intraoperative date)

Шкала	Показатель
	rs	р	rs	р	rs	р
В группе 1 (без дисплазии соединительной ткани)
Nair	0,47	0,01	0,41	0,02	0,19	0,07
F. Coccolini	0,36	0,02	0,37	0,2	0,32	0,09
Н.И. Аюшинова и соавт.	0,29	0,01	0,21	0,17	0,27	0,02
В группе 2 (с недифференцированной дисплазией соединительной ткани)
Nair	0,19	0,01	0,21	0,04	0,29	0,005
F. Coccolini	0,27	0,02	0,18	0,06	0,26	0,007
Н.И. Аюшинова и соавт.	0,21	0,01	0,26	0,003	0,25	0,004

 

При морфологическом анализе полученных микропрепаратов выявлено наибольшее скопление активных фибробластов и мезотелиоцитов в группе 1, нежели чем в группе 2, что является прямым показателем процесса фибриногенеза. Также визуализировалась инфильтрация нейтрофилами и полиплоидными макрофагами. В группе 2, у детей с ДСТ, в спайках отсутствовали (56 %) или имелись хаотичные фрагменты (44 %) коллагена I типа (рис. 1), а коллаген III типа располагается беспорядочно и присутствует в составе фибрилл.

 

Рис. 1. Микропрепарат биоптата структур соединительной ткани при спаечном процессе брюшной полости в группе 2. Выявлены активные фибробласты и в интрацеллюлярном пространстве коллагеновые волокна I типа. Докрашивание гематоксилином. Окуляр с разрешением 10, вместе с объективом дает увеличение ×400 / Fig. 1. Micropreparation of a biopsy specimen of connective tissue structures during adhesions of the abdominal cavity in group 2. Active fibroblasts and type I collagen fibers were found in the intracellular space. Hematoxylin staining. Eye-lens 10, ×400

 

Соотношение коллагена I типа к коллагену III типа составляло 2,7:5,1. Однако высокая экспрессия коллагена IV типа наблюдалась во всех биоптатах (87,9 %). В группе 1, по результатам ИГХ, в спайках наблюдались параллельно идущие нити коллагена I типа, расположенного в межклеточном пространстве (рис. 2), меньшая экспрессия — у коллагена III типа. Отмечалась ярко выраженная пролиферация активных фибробластов.

 

Рис. 2. Микропрепарат биоптата соединительной ткани при спаечном процессе брюшной полости в группе 1. Иммуногистохимическое исследование показателя экспрессии моноклональных кроличьих антител к коллагену III типа. Докрашивание гематоксилином. Окуляр с разрешением 10, вместе с объективом дает увеличение ×400 / Fig. 2. Micropreparation of connective tissue biopsy specimen of the abdominal cavity adhesion in the main group. Immunohistochemical study of the expression indicator of monoclonal rabbit antibodies to type III collagen. Hematoxylin staining. Eye-lens 10, ×400

 

Соотношение коллагена I типа к коллагену III типа составляла 5,9:1,8. Коллаген IV типа, как показатель активного ангиогенеза, был обнаружен в базальной мембране эндотелия сосуда. ИГХ-анализ выявил высокую экспрессию в данных спайках коллагена IV типа. При этом соотношение коллагена IV типа к коллагену I типа было 6,5:2,9. В спайках, располагавшихся между сальником и кишечной трубкой, отмечали параллельно расположенные пучки коллагеновых волокон III типа в меньшем количестве.

При подсчете антител было обнаружено: в обеих группах имелось умеренное (++) количество TGF-β-позитивных фибробластов и клеток эпителиоидной природы. По большей части были обнаружены TGF-β-позитивные клетки и макрофаги (рис. 2) (U = 50,51, p < 0,001). Результаты подсчета FGFR1 в спаечной ткани были непостоянны в группе 1 (0/++), нежели в группе 2 (++++). Положительная реакция была замечена в фибробластах и макрофагах (U = 79,00, р = 0,006). Статистически значимая положительная корреляция была обнаружена между FGF-1 и TGF-β (rs = 0,47, р < 0,001). В спайках группы 2 фактор эндотелиоцитов bFGF (+/++) и Laminin γ1 (0/++) в базальной мембране, в сравнении с показателями в группе 2 bFGF (+++) и Laminin γ1 (++++), статистически значимо расхождение показателей (U = 56,3, р = 0,001). Также в основной группе наблюдается менее выраженное накопление bFGF и ламинина в спайках между петлями кишечниками, при этом обнаружена высокая сконцентрированность VEGF в спайках между сальником и кишечной стенкой. Статистически значимый анализ касался VEGF в сравниваемых группах (rs = 0,632, р < 0,001), который имел положительную корреляцию (табл. 2).

 

Таблица 2. Полуколичественная оценка антител при иммуногистохимическом исследовании / Table 2. Semi-quantitative assessment of antibodies with immunohistochemical study

Фактор	Показатель позитивности
	TGF-β	FGFR1	Laminin γ1	bFGF	VEGF
Группа 1	++	++++	++++	+++	++++
Группа 2	+	0/++	0/++	+/++	++
U	50,51	79,00	64,12	47,8	28,4
p	<0,001	0,006	0,003	0,007	0,024
Корреляция	rs = 0,47, р < 0,001		rs = 0,52, р < 0,001		rs = 0,632, р < 0,03

Обсуждение

Проведенный нами макроскопический анализ спаек в брюшной полости, а также подкрепление ИГХ-картины фибриногенеза может сформировать расширенное представление процесса образования спаек у детей, особенно у детей с ДСТ [26, 27]. Ведь до сих пор в литературе можно встретить синонимы термина ДСТ — «мезенхимальная недостаточность», «мезенхимальная дисплазия», «слабость соединительной ткани», «соединительнотканная дисплазия со смешанным фенотипом», «генерализованная ДСТ, включающая MASS-фенотип», «изолированная соединительнотканная дисплазия», «синдром соединительнотканной дисплазии» [28, 29]. На основании наблюдений M.J. Glesby и соавт. [30, 31], где обследовались пациенты с признаками ДСТ, во всех случаях выявлены значительные изменения экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани. Позже для описания таких пациентов авторы предложили термин «MASS-фенотип» (Muscle, Aorta, Skeleton, Skin) [32]. Касаемо детского возраста, главной задачей врача стоит распознавание и выделение групп риска с ДСТ, ведь в сопутствующем проявлении данного заболевания возможно образование большого количества осложнений. Изучение макроскопического строения спаечного процесса в брюшной полости лежит в приоритете дальнейшего анализа, особенно у детей с НДСТ. В литературе мало изучены сравнительные характеристики фибриногенеза у детей, так как активность клеточной популяции соединительной ткани и ее реактивность у детей намного выше, нежели у взрослых. Результаты проведенных исследований ряда авторов [33] показали, что образование спаек в брюшной полости связано с факторами ангиогенеза и процессом образования фибробластов, для этого необходимо изучение внеклеточного матрикса (ламинина), васкулоэндотелиального фактора и фактора роста фибробласта. Но у детей с НДСТ вышеуказанные факторы не могут сформировать точной прогностической картины, с возможным развитием атипично текущего спаечного процесса [34]. Что также подтверждается неуточненными данными о количественной и качественной картине типа коллагеновых волокон при спаечном процессе брюшной полости у детей с НДСТ [35, 36].

Заключение

Таким образом, проведенное исследование показало особенности клинического течения и морфологических изменений при развитии спаечного процесса брюшной полости у детей с различной степенью выраженности дисплазии соединительной ткани. Преобладающим типом СКН у детей без ДСТ был обтурационный (66,7 %), у детей с признаками ДСТ — странгуляционный (86,4 %). Полученные данные диктуют необходимость индивидуального подхода в прогнозировании спаечной болезни, а также в построении целенаправленной программы лечебно-профилактической помощи детям.

Дополнительная информация

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

About the authors

Sergey V. Minaev

Stavropol State Medical University

Email: sminaev@yandex.ru

Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the Department of Pediatric Surgery with the course DPO

Russian Federation, Stavropol

Sergey I. Timofeev

Magadan Regional Children’s Hospital

Email: alina.mashchenko@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Head of the department of pediatric surgery

Russian Federation, Magadan

Alina N. Grigorova

Stavropol State Medical University

Author for correspondence.
Email: alina.mashchenko@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Associate Professor of the Department of Pediatric Surgery, assistant Department of Histology

Russian Federation, Stavropol

Oksana V. Vladimirova

Stavropol State Medical University

Email: alina.mashchenko@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Associate Professor of the Department of Pediatric Surgery with DPO Course

Russian Federation, Stavropol

Elena I. Pashneva

Stavropol State Medical University

Email: alina.mashchenko@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Associate Professor of the Department of Histology

Russian Federation, Stavropol

Evgeniy G. Kolesnikov

Kuban State Medical University

Email: alina.mashchenko@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Assistant of the Department of surgical diseases in children

Russian Federation, Krasnodar

References

Supplementary files